Ginkgo: le remue-mémoire!

Partie IIII : L’expérimentation

 

Nous avons vu, à la première partie de ce recueil, toute l’importance qu’a la mémoire dans notre vie. Nous avons fait la distinction logo.jpg (173038 bytes)entre mémoire et apprentissages, et nous avons vu les différents types de mémoire. Nous avons de plus appris qu’il y a différentes zones de notre cerveau activées lors de la mémorisation d’une simple information. Enfin, nous avons pu voir la mémorisation à travers nos neurones, ces cellules à la base du cerveau. À la deuxième partie, nous avons parlé de la maladie d’Alzheimer et des ennemis qui menaçaient la mémoire, tels les plaques séniles et les radicaux libres. Nous avons également compris que notre système produit naturellement, chaque jour, des radicaux libres, qui agissent par le même processus que dans la maladie d’Alzheimer (bris de la membrane, puis bris de structures vitales à l’intérieur du neurone). Finalement, à la troisième partie, sur une note un peu plus positive, nous avons parlé de six produits comportant des propriétés antioxydantes et/ou neuroprotectrices. Les antioxydants permettraient d’éliminer les radicaux libres, tandis que les neuroprotecteurs assureraient une meilleure cicatrisation des neurones et les protégeraient des substances nuisibles. Nous sommes donc enfin rendus à la quatrième partie traitant du but même de tout mon projet d’expo-sciences 1999, c’est-à-dire de comparer les six produits que nous venons de décrire.

 

But :

En effet, ces six produits, très prometteurs selon la littérature et les chercheurs, n’ont jamais été comparés entre eux. Voilà donc le but de ce projet d’expo-sciences : comparer les six produits, au moyen de deux tests différents, au plan de l’élimination des radicaux libres d’une part et de la protection des neurones contre la substance bêta-amyloïde, d’autre part. Ceci afin de déterminer lequel est le meilleur antioxydant et lequel permet la plus grande protection des cellules neuronales.

 

Hypothèse :

À partir de ce tout que nous avons appris en ce qui a trait à la mémoire, aux neurones, à la maladie d’Alzheimer, aux radicaux libres ainsi qu’aux six produits à tester, nous pouvons formuler une hypothèse : le produit qui réussira à sauvegarder le plus de neurones devra avoir à la fois des propriétés antioxydantes et neuroprotectrices. Il devra donc premièrement pouvoir éliminer les radicaux libres. Mais puisque, comme nous l’avons vu, les radicaux libres agissent très rapidement (10-11 seconde), il faut qu’en plus de pouvoir éliminer les radicaux libres restants, que le produit puisse éventuellement permettre de cicatriser le neurone endommagé, et permettre par exemple d’éliminer du milieu intracellulaire les substances indésirables. La substance devra donc être également neuroprotectrice. Le Ginkgo biloba, le resveratrol et la vitamine E sont des antioxydants. L’estradiol, l’IGF et la DHEA sont neuroprotecteurs. Si l’un de ces produits possède aussi l’autre caractéristique, il devrait, à mon avis, permettre une plus grande survie des neurones.

 

Liste de matériel :

L’expérimentation s’est déroulée au Centre de recherche de l’Hôpital Douglas, affilié à l’Université McGill. Le matériel comprenait : 2 plats à 96 cavités, 6 ependorffs, 2 récipients de 500 ml, 1 seringue, 1 pipette Pasteur, 1 micropipette avec embout, 1 micropipette avec peigne, vortex, 1 éprouvette, incubateur, centrifugeuse, pompe à vide, hotte à flow laminaire, spectrophotomètre, éthanol, DCF, MTT, liquide riche en glucose, sérum de fœtus de bovin, enzymes dissociatrices (trypsine), P.E.P, ainsi que les six produits testés énumérés plus haut.

 

Manipulations

Partie I : Culture des cellules neuronales

41.jpg (57037 bytes)Comme nous l’avons dit, l’expérimentation vise à comparer l’efficacité de six produits au plan de l’élimination des radicaux libres et de la protection de neurones endommagés par l’Ab . L’expérimentation se déroule donc totalement sur des neurones. Avant d’endommager les neurones puis de tenter de les sauvegarder avec les six produits, j’ai donc dû en faire croître. La culture de neurones est une opération extrêmement délicate. La moindre erreur peut tout gâcher. Imaginez : on fait croître des neurones dans des plats en plastique! Il faut donc que tout soit bien contrôlé, tout soit bien dosé. Apprendre à mettre en culture des neurones n’est pas une chose facile. Cela prend généralement 4 à 6 mois. Étant donné que le but de mon expérimentation n’était pas de faire croître tout bonnement des neurones mais de comparer des produits, j’ai décider d’assister un spécialiste du Centre de recherche dans la mise en culture plutôt que de me pratiquer pendant six mois. Cependant, je comprends maintenant très bien les différentes étapes.

On l’a vu, des neurones, c’est fragile! Ce l’est encore plus dans une mise en culture. Il faut absolument que l’environnement dans lequel on travaille soit complètement stérile. C’est pour cela que nous travaillons la majeure partie du temps dans une hotte à flow laminaire. À chaque fois qu’on sort notre main de la hotte, il faut donc la nettoyer avec de l’éthanol. À première vue cela semble presque " maniaque ", mais on comprend rapidement que des neurones, c’est fragile!

Voici donc les étapes de la mise en culture. Le protocole se trouve à l’annexe 1 à la fin de ce recueil. Il faut tout d’abord préparer à l’intérieur de trois récipients différents des solutions de milieu de culture. Ces trois solutions serviront un peu plus tard à 1- la dissection des hippocampes, 2- la dissociation des neurones et 3- la mise en culture. Étant donné qu’après la dissection, les neurones sont coupés des substances nutritives, donc de leur carburant pour fonctionner, il faut leur en fournir. Le premier constituant de la solution de milieu de culture est du liquide riche en glucose. Les neurones adorent le glucose, et il leur permet de bien fonctionner. L’autre constituant de la solution, c’est du sérum de fœtus de bovin. La proportion est 1/10 de sérum de fœtus de bovin contre 9/10 de liquide riche en glucose. Le sérum est rempli de constituants bénéfiques pour la croissance des neurones : facteurs de croissance, antibiotiques, vitamines… tous les éléments nécessaires à la croissance d’un fœtus de bovin seront donc, via la solution de milieu de croissance, administrés à nos chers neurones. Lorsque les trois récipients sont remplis de la même solution, on verse le contenu du premier dans trois plats Pétri dans lesquels on procédera à la dissection des cerveaux de fœtus de rats.

Parallèlement à cette opération, il faut également préparer les 2 plats à 96 cavités chacun, dans lesquels croîtront les neurones. Dans chacune des toutes petites cavités, environ 10000 neurones croîtront! Il faut mettre, dans chacune de ces cavités, 100 ul (microlitre) d’un adhésif appelé P.E.P (Poly Éthano Propylène), sur lequel les neurones fixeront leurs prolongements pour croître. Sans le P.E.P., les neurones déposés au fond de chacune des cavités ne pourraient évidemment pas croître sur du plastique et mourraient. Il leur faut donc un adhésif pour se fixer, comme une jeune plante se fixe à son tuteur pour croître.

42.jpg (68387 bytes)Les préalables sont donc remplis. Nous pouvons maintenant passer à la dissection. Avec le scalpel et les ciseaux, il faut tout d’abord prélever les fœtus de 3 rates. Chaque rate contient environ 15 fœtus. Après les avoir prélevés, il faut les séparer, en découpant leur placenta. Par la suite, on garde uniquement les embryons encore vivants et on retire leur cerveau. Si on gardait le cerveau des fœtus morts même depuis seulement quelques secondes ou minutes, lorsqu’on mettrait en culture leurs neurones, ceux-ci seraient morts depuis trop longtemps. Ils ne croîtraient donc pas, et cela pourrait fausser nos résultats. Il faut donc être très vigilant. Après avoir enlevé le cerveau, on prélève l’hippocampe de chacun d’eux. Cette opération est encore une fois très délicate. Le cerveau des fœtus qui ne sont eux-mêmes pas très gros, a un hippocampe de la taille d’une tête d’épingle! L’hippocampe des fœtus est de la forme d’une banane et est assez facile à repérer, avec de l’expérience! Après cette opération qui se déroule toujours dans les plats Pétri remplis de solutions de milieu de culture, on enlève l’excédant des hippocampes, comme par exemple la graisse ou les vaisseaux sanguins qui les entourent. On veut garder uniquement des neurones. Voilà, la dissection est faite. Il faut maintenant passer à la dissociation des neurones.

44.jpg (114228 bytes)

46.jpg (63203 bytes)On place donc délicatement les hippocampes dans une éprouvette dans laquelle on a versé préalablement une partie de la solution de milieu de culture du deuxième récipient, qui avait été préparée au début de l’expérimentation. Avec une pipette Pasteur, on enlève la solution en gardant les hippocampes au fond de l’éprouvette, on jette la solution et on en verse de la nouvelle. Cette opération de rinçage doit être répétée cinq fois. On aura donc éliminé les déchets produits par les neurones lors de la dissection ainsi que les substances (graisses, vaisseaux sanguins) encore présentes autour des neurones. Après cela on rajoute dans l’éprouvette ¼ de trypsine. Cette enzyme sert à dissocier les neurones. En effet, les neurones sont présentement attachés entre eux par une membrane commune. La trypsine viendra donc gruger cette membrane, afin de nous permettre de retrouver dans notre éprouvette des neurones tous indépendants les uns des autres. Après avoir ajouté cette enzyme à l’éprouvette, on place l’éprouvette 10 minutes dans l’incubateur, pour permettre à la trypsine de faire son travail.

Pendant ce temps, on ne perd pas notre temps! On revient à nos plats à 96 cavités dans lesquels on avait ajouté du P.E.P., cet adhésif qui permet aux neurones de croître en se fixant à lui. Avec une pompe à vide, il faut 45.jpg (76037 bytes)maintenant enlever le P.E.P. de chacune des cavités. Bien entendu, on ne réussira pas à enlever la totalité du P.E.P. En effet, il restera une toute petite couche dans le fond. C’est exactement ce que l’on veut, puisque les neurones vont se déposer au fond après la mise en culture et vont se fixer à lui pour croître! Pour ne laisser qu’une minuscule couche, on va finalement rincer chacune des cavités en leur ajoutant de l’eau puis en la retirant.

Les 10 minutes écoulées, on peut sortir notre éprouvette de l’incubateur. Avant de la remettre dans la hotte à flow laminaire, il faut bien sûr la rincer et rincer nos mains avec de l’éthanol. La trypsine a donc théoriquement bien fait son travail. Pour ne pas qu’elle continue à gruger les membranes et briser peut-être celle des neurones maintenant dissociés jusqu’à aller gruger la membrane nucléaire, il faut la stopper, en la retirant. Avec la pipette Pasteur, on retire donc le liquide de l’éprouvette tout en gardant les neurones déposés au fond, puis on ajoute de la nouvelle solution de milieu de culture, prise dans le deuxième récipient. On la retire ensuite et on en rajoute de la nouvelle et on refait 5 fois cette opération de rinçage! Il restera donc une infime quantité de trypsine. Mais elle continuera cependant à agir. On rajoute donc, 1/10 de sérum de fœtus de bovin à l’éprouvette, qui contient des inhibiteurs 47.jpg (52634 bytes)de trypsine.

Les neurones ne sont plus liés entre eux. Mais il reste encore des amas dans le fond de l’éprouvette. Il faut donc encore plus dissocier le contenu de l’éprouvette. Tout d’abord, avec la pipette Pasteur, on aspire le contenu, et on l’expulse à nouveau dans l’éprouvette. On pratique cette opération de brassage jusqu’à ce que les particules du fond (les neurones) soient diluées. Pour encore plus diluer le tout, on prend par la suite une seringue, et on aspire et expulse, plusieurs fois. Lorsque notre liquide est homogène, on met l’éprouvette dans une centrifugeuse pendant 10 minutes.

10 minutes plus tard, après avoir lavé l’éprouvette et nos mains avec de l’éthanol, on retourne à la hotte à flow laminaire! On verse par la suite le contenu de l’éprouvette dans une autre éprouvette, mais sur laquelle se trouve une passoire, percée de trous pouvant laisser passer des neurones. La passoire va donc retenir des substances indésirables plus grosses que les neurones, tels que des membranes lipidiques détruites par la trypsine, des vaisseaux sanguins, etc. Ensuite, on verse le contenu de la nouvelle éprouvette, ayant filtré de la passoire, dans la solution de milieu de culture du troisième récipient qu’on a préparée en début d’expérimentation. Avec une micropipette à peigne, on ajoute dans chacune des cavités des deux plats à 96 cavités chacun 100 µL de la nouvelle solution, composée de neurones toujours vivants et de la solution de milieu de culture. Les neurones sont enfin mis en culture! On place donc finalement les plats dans un incubateur pendant 3 jours, à 37°C : la même température que les fœtus de rats ont connu dans le ventre de leur mère. Il y a donc, dans chacune des 192 cavités de nos 2 plats, environ 10000 neurones, dans un liquide qui leur permet de croître. Au fond de chacune des cavités se trouve une mince couche de P.E.P., cet adhésif sur lequel les neurones vont se déposer et se fixer pour croître!

Au quatrième jour, on va retirer avec la micropipette la solution de milieu de culture de chacune des cavités, pour en remettre de la nouvelle. On procède en fait à cette opération puisque l’ancien milieu de culture est rempli de déchets éliminés par les neurones pendant 3 jours, et ne contient plus les substances nutritives nécessaires à la vie des neurones. Après avoir remplacé la solution de milieu de culture, on replace donc les deux plats dans l’incubateur et ce, pour 3 autres jours.

 

Partie II : Endommagement des neurones

48.jpg (71460 bytes)La deuxième partie de l’expérimentation consiste donc à endommager les neurones, qui sont enfin arrivés à maturité, avec du H2O2 d’une part, qui libérera des radicaux libres, et par de la bêta-amyloïde d’autre part. Par la suite, nous mettrons les neurones endommagés en présence de chacun des six produits et nous pourrons finalement comparer l’efficacité des six produits à éliminer les radicaux libres et à protéger les neurones de l’AB . Le protocole de cette partie se trouve à l’annexe 2 à la fin de ce recueil.

Nous sommes donc rendus au huitième jour de l’expérimentation. Les neurones que nous avons fait croître sont donc arrivés à pleine maturité. Avant de les sortir de l’incubateur, nous devons préparer des solutions. Premièrement, on prépare dans un récipient de 350 ml une nouvelle solution de milieu de culture, la même que nous avons utilisée dans les étapes auparavant (1.5 ml de sérum de fœtus de bovin pour 100 ml de liquide riche en glucose). Par la suite, il faut préparer les solutions avec lesquelles nous endommagerons les neurones. Dans une éprouvette, on place donc 50 µM de H2O2 par litre de la solution de milieu de culture préparée préalablement. µ représente micro, c’est-à-dire 10-6, tandis que M représente " mole ". Mole est une unité de mesure qui équivaut à 6.02 X 1023 molécules d’une substance donnée. Cette unité nous permet de comparer les masses d’éléments différents du tableau périodique, en prenant le même nombre de particules pour chacun d’eux. Dans ce cas-ci, mole signifie donc 6.02 X 1023 molécules de H2O2. Étant donné qu’une mole d’hydrogène équivaut à 1 gramme et qu’une mole d’oxygène équivaut à 16 grammes, une mole de H2O2 équivaut donc à 34 grammes (1g+1g+16g+16g=34g). Lorsqu’on place donc 50 µM de H2O2 par litre de solution de milieu de culture, on place 0.0017 g de H2O2 (50 µM X 34g X 10-6 )! Cela est très minime et on comprend donc toute l’utilité qu’à l’unité " mole " pour les solutions. 49.jpg (67021 bytes)Résumons-nous donc : nous diluons 50 µM de H2O2 pour chaque litre de solution de milieu de culture. On aura donc très peu de H2O2 dans notre solution finale, mais ce sera suffisant pour tuer les neurones. N’oublions pas que des neurones, c’est très très petit! Voilà, la solution de H2O2 qui libérera des radicaux libres pour endommager les neurones est donc préparée. Il reste cependant à préparer la solution de bêta-amyloïde. Nous avons vu dans la deuxième partie de ce recueil que dans la maladie d’Alzheimer, deux types de fragments de l’APP sont libérés et s’accumulent sous forme de plaques séniles. Ces deux types, ce sont les fragments 1-40 et 1-42. Ces chiffres font référence à leur nombre d’acides aminés. Ces fragments sont cependant très coûteux, provenant directement des cerveaux de patients décédés,t. Il s’en fabrique donc en laboratoire, qui sont beaucoup moins coûteux. Ce sont les fragments 25-35. On ne retrouve pas ces fragments dans la maladie d’Alzheimer, mais ils agissent comme les fragments 1-40 et 1-42. Nous utiliserons donc, pour l’expérimentation, les fragments 25-35, afin d’endommager les neurones à la manière de la maladie d’Alzheimer. Pour préparer la solution de bêta-amyloïde, il faut donc diluer dans une éprouvette 25 µM d’AB 25-35 par litre de solution. Encore une fois, on aura très peu d’AB dans notre solution finale, mais ce sera amplement suffisant pour tuer les neurones.

Maintenant que nous avons préparé les deux solutions avec lesquelles nous tuerons les neurones, il faut préparer les solutions des six produits avec lesquels nous tenteront d’éliminer les radicaux libres d’une part et de protéger les neurones de l’AB d’autre part. Nous testerons deux concentrations différentes par produit. Nous aurons donc 12 solutions différentes. Tout d’abord, dans deux ependorffs différents, nous diluons 50 et 100 µg (micro-gramme donc 1 gramme X 10-6 ) d’extrait de Ginkgo biloba par millilitre d’eau. Dans deux autres ependorffs, nous diluons 25 et 50 µM (micro-mole) de resveratrol par litre d’eau. Bien entendu, il n’entre pas un litre d’eau dans un ependorff. On garde cependant ces même proportions pour faire une solution de plus petite quantité, pouvant être contenue dans un ependorff. Dans deux autres ependorffs, nous faisons une solution de trolox en gardant les même proportions de 50 et 100 µM de trolox pour 1 litre d’eau. Dans deux autres ependorffs, nous faisons la solution de l’estradiol en gardant les même proportions de 10 et 20 µM d’estradiol pour 1 litre d’eau. Dans deux autres ependorffs, nous diluons 50 et 100 µg (micro gramme) de DHEA par millilitre d’eau. Enfin, dans deux dernièrs ependorffs, nous préparons une solution d’IGF en gardant les mêmes proportions de 30 et 60 nM (nano-mole, donc 1 mole X 10-3 ) pour 1 litre d’eau. Ouf! Il y en a des concentrations! Encore une fois, les produits sont extrêmement dilués dans l’eau. Ils sont donc administrés aux neurones en très petites quantités, mais c’est la bonne quantité pour les neurones. Les quantités de produit à administrer ont en fait été trouvées à partir d’articles, de recherches, des posologies pour chaque produit ainsi qu’en fonction des masses moléculaires des différents produits.

410.jpg (59916 bytes)Maintenant que les très nombreux préalables à la deuxième partie de l’expérimentation sont accomplis, on peut enfin sortir les neurones de l’incubateur, s’ils ne sont pas morts d’attente! On place donc dans la hotte à flow laminaire les deux plats que nous avons bien lavés avec de l’éthanol pour ne pas polluer notre milieu de culture. Avec la pompe à vide, on retire de chacune des cavités des deux plats la solution de milieu de culture. Avec la micropipette avec peigne, on ajoute ensuite à chacune des cavités du premier plat (sauf celles des deux premières rangées) 1 µL de solution de H2O2 que nous venons de préparer. Les neurones de l’ensemble des cavités de ce plat seront donc endommagés par des radicaux libres, sauf ceux des deux premières rangées de cavités, qui seront les cavités témoins dans lesquelles les neurones n’auront pas été attaqués par le H2O2. Ensuite, on place, avec la micropipette avec embout, dans les 4 premières cavités voisines venant d’être mises en présence du H2O2 , 1 µL de notre première solution, soit 50 µg/ml de Ginkgo biloba. On place ensuite 1 µL de la deuxième solution dans les 4 cavités suivantes, soit la solution de 100 µg/ml de Ginkgo, et ainsi de suite pour les 10 autres solutions. On laisse les 4 dernières cavités voisines sans produit : ce seront les cavités témoins où les neurones auront été endommagés par du H2O2 mais sauvegardés par aucun produit. Cela nous permettra donc, en comparant les produits, de savoir lequel permet la meilleure élimination des radicaux libres. Il est très important de ne pas oublier d’identifier les cavités avec le produit qui leur a été411.jpg (81756 bytes) administré, pour permettre par la suite une comparaison entre les 6 produits lors de la lecture des résultats. Par la suite, on prend le deuxième plat. On place à l’aide de la micropipette avec peigne dans chacune des cavités sauf celles des deux premières rangées, 1 µL de la solution de l’AB 25-35 préparée préalablement. Les neurones des cavités du deuxième plat seront donc endommagés par le même processus que dans la maladie d’Alzheimer, sauf ceux des cavités des deux premières rangés, qui seront les cavités témoins où les neurones n’auront pas été endommagés par l’AB 25-35. Avec la micropipette avec embout, on distribue donc, 4 cavités par 4 cavités, les 12 solutions des 6 produits différents, comme nous l’avons fait pour le premier plat. On laisse finalement les 4 dernières cavités voisines sans produit, pour qu’elles soient les cavités témoins où les neurones auront été endommagés à l’AB 25-35 mais protégés par aucun produit. Il ne faut encore une fois pas oublier de bien identifier les cavités avec le produit qui leur a été administré, si on veut pouvoir comparer les produits!

Nous venons donc de mettre en présence les neurones de la plupart des cavités du premier plat de H2O2 , qui libérera des radicaux libres. Nous avons mis par la suite dans ces mêmes cavités une des 12 solutions d’un des 6 produits dans le but d’éliminer ces radicaux libres. Également, nous avons mis les neurones du deuxième plat en présence de la bêta-amyloïde, qui les attaquera comme dans la maladie d’Alzheimer (par libération de radicaux libres). Nous avons par la suite mis dans chacune de ces mêmes cavités une des 12 solutions d’un des 6 produits différents, dans la but de protéger les neurones contre l’AB . Il ne reste qu’à laisser le H2O2 et la bêta-amyloïde faire leur travail de destruction, tandis qu’il ne reste qu’à laisser les six produits faire leur travail de protection! On incube donc les deux plats pendant 24 heures. Le lendemain, nous aurons enfin nos résultats!

 

412.jpg (83167 bytes)Partie III : Lecture des résultats

Nous sommes enfin rendus à la lecture des résultats. Nous pourrons maintenant savoir quel produit est le meilleur antioxydant, et quel produit permet la plus grande protection des neurones. Pour ce faire, nous nous servirons de deux tests couramment utilisés en recherche : le test du DCF et le test du MTT. Le test du DCF permet de quantifier le nombre de radicaux libres encore présents, tandis que le MTT nous indique le taux de survie des neurones .

Voici donc les étapes de la lecture des résultats. Le protocole se trouve à l'annexe 3 à la fin de ce recueil. Nous sommes rendus au huitième jour de l'expérimentation, c'est-à-dire 24 heures après avoir endommagé les neurones du premier plat avec du H202 et ceux du deuxième plat avec de la bêta-amyloïde et avoir mis certaines cavités de ces plats en présence ou non des 6 produits (cavités témoins). Il faut donc maintenant retirer les 2 plats de l'incubateur, et les amener dans la hotte à flow laminaire. Avec la pompe à vide, on retire la solution de milieu de culture de chacune des cavités des deux plats. Nous en sommes donc à l'étape des deux tests différents.

Dans le premier plat, nous ferons le test du DCF pour chacune des cavités dans le but de mesurer le nombre de radicaux libres restants et donc l'efficacité antioxydante du produit spécifique à chacune des cavités. Le DCF signifie dichloroFluorescein diacetate. Ce produit devient fluorescent en présence des radicaux libres. En effet, lorsqu'il entre en contact avec ces derniers, sa forme initiale (2,7-dichlorofluorescein diacetate) se change en 2'7-dichlorofluorescein diacetate, un produit hautement fluorescent. Le DCF agit également sur le H2O2. À l'aide de la micropipette avec peigne, on ajoute donc 25 µM de DCF à chacune des cavités du premier plat. On le fait ensuite incuber pendant 3 heures, le temps nécessaire pour que le DCF puisse réagir avec les radicaux libres.

Dans le deuxième plat, nous ferons passer le test du MTT à chacune des cavités dans le but de mesurer l'activité respiratoire des mitochondries et donc l'efficacité du produit spécifique à chacune des cavités à protéger les neurones. MTT signifie Mitochondrial Test. Le MTT utilise un réactif (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) qui vire au bleu lorsqu'il est en contact avec des mitochondries fonctionnelles. Étant donné que l'Ab tue les neurones et arrête donc complètement l'activité respiratoire des mitochondries, nous pourrons voir grâce au MTT quel(s) produits auront permis de sauvegarder les neurones de l'action de l'Ab.



Résultats et discussion

414.jpg (79192 bytes)J'ai donc obtenu mes résultats grâce au spectrophotomètre. Celui-ci mesure en fait la densité optique. Dans le test du DCF, plus il y a de fluorescence et plus il y a de radicaux libres restants. Dans les 4 cavités voisines où je n'avais pas mis de H2O2, la lecture a donné 0. Dans les 4 cavités voisines dans lesquelles j'ai mis du H2O2 mais pas de produit neuroprotecteur, le résultat était de 10000. C'est donc pour cela que nous avons appelé ces deux groupes de 4 cavités voisines les cavités témoins. On peut donc comparer les résultats des autres cavités dans lesquelles on a mis un produit différent, et chiffrer en pourcentage l'efficacité d'élimination des radicaux libres (propriétés antioxydantes).

Pour ce qui est du test du MTT, plus le contenu de la cavité était bleu et plus il y avait à l'intérieur de l'activité respiratoire : donc plus il y avait de neurones vivants. Encore une fois, grâce au spectrophotomètre qui a lu la densité optique de chacune des cavités, j'ai pu chiffrer mes résultats. Les cavités dans lesquelles je n'avais pas de bêta-amyloïde donnaient comme lecture 400, tandis que les cavités dans lesquelles j'avais mis de la bêta-amyloïde mais aucun produit se lisaient 0. J'ai donc pu donner un pourcentage à chaque produit au niveau de la sauvegarde des neurones, en fonction de la lecture de chacune de leurs cavités respectives.

Voici donc les résultats des 6 produits. Il y en a qui sont étonnants, d'autres désolants et d'autres extrêmement épatants! Commençons donc en ordre décroissant le palmarès au niveau du taux e de neurones sauvegardés, suite à une exposition à la bêta-amyloïde .

graph.jpg (89719 bytes)


- L'Estradiol

mestra.jpg (11249 bytes)- L'estradriol a éliminé à sa plus forte concentration, 25 % des radicaux libres, ce à quoi je ne m'attendais pas. En effet, il n'est pas reconnu comme antioxydant. En regardant sa molécule, on comprend cependant pourquoi il a permis d'éliminer les radicaux libres. En effet, comme nous l'avons vu auparavant, les piégeurs de radicaux libres ont d'habitude une énorme structure qui leur permet de faire de la résonnance et/ou de l'encombrement stérique. C'est que ce la molécule d'estradiol lui permettrait.

- Fait étonnant, l'estradiol a sauvegardé 0% des neurones. L'estradiol, hormone féminine qui serait en manque à la ménopause et qui pourrait être en cause dans l'apparition de l'Alzheimer chez les femmes n'a donc démontré aucun effet neuro-protecteur. Cela pourrait être dû à une de ces deux raisons : 1- puisque l'estradiol est très peu antioxydant, il ne peut pas éliminer les nombreux radicaux libres et des dommages seraient alors causés très rapidement ou 2- l'estradiol n'a pas de propriétés neuro-protectrices et ne permet pas d'expulser les substances indésirables du milieu intracellulaire, de favoriser les systèmes de défense du neurone et d'aider à la cicatrisation du neurone.


- La DHEA

mdhea.jpg (12533 bytes)- La DHEA a, tout comme l'estradiol, permis d'éliminer une petite quantité de radicaux libres (±35 % à plus forte concentration). Encore une fois, cela serait dû à sa structure moléculaire qui lui permettrait de piéger une petite quantité de radicaux libres.

- La DHEA, neuro-stéroïde qui était supposé activer les systèmes de défense des neurones n'a permis de sauvegarder aucun neurone. Encore une fois, ce résultat est très étonnant. On peut supposer, comme pour l'estradiol, que la DHEA n'est pas assez antioxydante et que ce serait pour cette raison que les neurones seraient morts très rapidement ou bien encore que les propriétés neuro-protectrices de la DHEA sont trop faibles par rapport à l'endommagement que nous avons fait subir aux neurones dans cette expérience.


- La vitamine E
mvite.jpg (13329 bytes)- La vitamine E a démontré d'excellentes propriétés antioxydantes. Elle a éliminé en fait ± 85% des radicaux libres à sa plus forte concentration. Comme la littérature l'indiquait, c'est une véritable dévoreuse de radicaux libres! Et ici encore, c'est grâce à sa structure moléculaire!Malgré cela, la vitamine E n'a malheureusement pas protégé du tout les neurones de la bêta-amyloïde, à l'encontre de ce que propose la littérature. Mais cela vient par contre confirmer mon hypothèse de départ. pensais en effet que pour pouvoir sauvegarder les neurones, le produit devait être à la fois antioxydant et neuro-protecteur.

- La vitamine E permet d'éliminer les radicaux libres et est donc de ce fait antioxydante. Cependant, étant donné que les radicaux libres agissent extrêmement vite (10-11 secondes), il est sûr que certaines régions de la membrane ont pu être endommagées. Il y a donc eu par la suite une entrée de substances indésirables (ions calcium, radicaux libres et bêta-amyloïde) et cela serait la cause de la mort des neurones. En d'autres mots, même si la vitamine E élimine certains radicaux libres, il s'en produit tellement qu'il faut avoir un produit qui permettra à la fois d'éliminer l'ennemi et à la fois de cicatriser les neurones si des dommages ont été faits.

 419.jpg (139018 bytes)


- L'IGF
417.jpg (78560 bytes)- L'IGF a éliminé 0 % de radicaux libres. Il est en fait le seul produit à ne pas avoir éliminé de radicaux libres. Je m'attendais à ce résultat , l'IGF n'étant pas reconnu comme antioxydant.


- L'IGF a permis la sauvegarde de 85 % des neurones. Cela est un excellent résultat, d'autant plus que l'IGF n'est pas antioxydant. Selon moi, il aurait pu atteindre la barre des 100 % s'il avait eu en effet des propriétés antioxydantes. Comme nous l'avions vu, l'IGF agit sur les récepteurs à insuline, ce qui provoque une série de réactions pour aboutir à une plus forte consommation de glucose par les neurones. Cela a pour effet de permettre une activité plus efficace de l'ensemble des composantes du neurone, en particulier ses systèmes de défense. Également, étant donné que le neurone consomme plus de sucre, sa membrane grossit et il croît davantage. De nouveaux prolongements neuronaux poussent en effet à d'autres endroits du neurone. Mais étant donné que dans la maladie d'Alzheimer, les plaques séniles deviennent de plus en plus nombreuses autour des neurones, le fait de produire des prolongements neuronaux à d'autres endroits ne corrigerait pas la situation : à long terme, l'ensemble du neurone serait touché. Dans un cerveau normal cependant, l'IGF serait très bénéfique pour les neurones, permettant à ces derniers de se cicatriser lorsqu'ils se font attaquer par des radicaux libres et qu'ils sont en attente d'antioxydants.

 

418.jpg (72188 bytes)- Le resveratrol

- Le resveratrol a démontré d’excellentes propriétés antioxydantes. Il a permis en effet d’éliminer ± 85 % des radicaux libres et ce, à sa plus forte concentration. Il est très intéressant de remarquer que la molécule de resveratrol est très similaire à celle de la vitamine E ainsi qu’à celle des flavonoïdes du Ginkgo biloba, tous deux excellents antioxydants.

- Le resveratrol a démontré également d’excellentes propriétés neuro-protectrices. Il a protégé en fait ± 90 % des neurones de la bêta-amyloïde! Il est en fait le deuxième au classement. Le resveratrol permettrait d’éliminer la plupart des substances indésirables entrées dans le milieu intracellulaire. Il aiderait à diminuer le stress oxydatif et permettrait de guérir les régions endommagées. C’est probablement ses propriétés antioxydantes et neuro-protectrices, agissant en synergie qui permettraient une si efficace neuro-protection. En effet, comme mon hypothèse le disait, le resveratrol, à la fois antioxydant et neuro-protecteur, permettrait d’éliminer les radicaux libres et de cicatriser les blessures après que le mal a été fait. Pour ce qui est du 10 % restant de neurones morts, cela pourrait être dû à la non totale élimination des radicaux libres, ce qui a tout de même causé d’importants dommages.

 

- Le Ginkgo biloba

- Le Ginkgo biloba a éliminé 100 % des radicaux libres! Le fait qu’il soit composé de plusieurs excellents antioxydants (flavonoïdes, terpénoïdes…) agissant en synergie a sûrement grandement aidé à l’élimination des différents types de radicaux libres. Ce résultat est grandement étonnant ; le Ginkgo a permis une meilleure élimination des radicaux libres que son amie la vitamine E, qui est selon la littérature le produit au top des dévoreurs de radicaux libres! Bravo au Ginkgo!

- Également, un seul produit a permis de protéger 100 % des neurones. C’est bien entendu le Ginkgo biloba! Il est d’une force phénoménale! Le fait, premièrement, qu’il a éliminé 100 % des radicaux libres a sûrement grandement aidé à la protection des neurones. Et s’il y a eu certains radicaux libres qui ont réussi à détruire certains fragments de la membrane et qu’il y a eu par la suite une entrée de substances indésirables, le Ginkgo s’est empressé de leur montrer, poliment, la porte de sortie! Également, le Ginkgo permettrait de stopper la libération de nouveaux radicaux libres par la bêta-amyloïde. Cela serait toute une propriété neuro-protectrice! Sachant que dans la maladie d’Alzheimer, c’est la libération de radicaux libres par la bêta-amyloïde qui détruit complètement les neurones, la consommation de Ginkgo chez les patients atteints de cette maladie permettrait peut-être d’atténuer les dommages causés par la bêta-amyloïde. Le fait de stopper la libération de nouveaux radicaux libres permettrait donc d’expliquer la si forte élimination de radicaux libres par le Ginkgo et le si grand taux de survie des neurones. En résumé, le Ginkgo empêcherait peut-être dès le début la nouvelle libération de radicaux libres par la bêta-amyloïde, se chargerait par la suite d’éliminer les radicaux libres restants et expulserait finalement les quelques substances indésirables qui seraient entrées dans le milieu intra-cellulaire. Chapeau au Ginkgo!

420.jpg (136273 bytes)

Conclusion

logo.jpg (173038 bytes)Les résultats viennent donc confirmer mon hypothèse de départ disant que le produit qui protègerait le plus les neurones serait celui ayant à la fois les meilleures propriétés antioxydantes et neuroprotectrices. Le Ginkgo biloba, premier au classement, a en effet des propriétés antioxydantes extrêmement puissantes et des propriétés neuro-protectrices qui s’attaquent au coeur même du problème (libération de radicaux libres par la bêta-amyloïde)

Ce projet concernant la mémoire va rester gravé dans la mienne! Comprendre le fascinant processus de la mémoriation, voir comment des substances toxiques précises viennent le mettre en danger et comment d’autres substances peuvent prévenir et contrer cette menace, cela a été un travail préalable ardu mais des plus intéressant. L’expérimentation comme telle a dépassé mes attentes, particulièrement en ce qui a trait à l’étonnant Ginkgo biloba : mère Nature est vraiment de notre bord! L’arbre millénaire, seule espèce vivante à avoir survécu à Hiroshima tient peut-être dans ses feuilles la réponse pour la survie de notre mémoire humaine.

-" Ouf! Maintenant, j’ai moins peur de vieillir!"

 


Précédent


=> page principale


© David Laflamme, davidlaflamme@videotron.ca, école secondaire Montcalm, expo-sciences 1999