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> La neuromodulation in vivo!

 

 

Afin de mettre à l'épreuve les substances susceptibles d'être neuromodulatrices cholinergiques positives et plus particulièrement l'extrait de Ginkgo biloba, un test in vivo, sur des rats, a été mis au point.

Sommaire

> Article 1
La brique du cerveau

> Article 2
Fascinante mémoire!

> Article 3
Les mécanismes moléculaires de la mémoire

> Article 4 Alzheimer: terrible mort neuronale

> Article 5
Bêta-amyloïde: un neuromodulateur négatif

> Article 6
Des neuro- modulateurs cholinergiques

> Article 7
La neuromodulation in vivo!

> Article 8
Ginkgo: neuromodulateur!

 

 

 

 

Définitions

Neuroprotecteur:   Substance capable de protéger les neurones contre la toxicité induite notamment par la bêta-amyloïde. Plusieurs neuroprotecteurs sont antioxydants.

 

 

 

 

 

Stabulation:        Phase durant laquelle les rats s'acclimatent à la chambre. Se fait généralement 2 fois durant deux minutes, le jour avant l'expérimentation.

 

 

 

 

 

 

Séance d'apprentissage: Séance de 2 minutes où chacun des rats est placé dans la chambre avec deux objets identiques. Précède d'une heure la phase de reconnaissance.

 

La maladie d'Alzheimer est caractérisée par une importante réduction du taux d'acétylcholine (jusqu'à 90%), particulièrement chez les neurones cholinergiques de l'hippocampe, la zone mémoire du cerveau. Cette baisse en acétylcholine est causée par les propriétés neuromodulatrices cholinergiques négatives de la bêta-amyloïde, cet étrange peptide qui s'accumule autour des neurones lors de cette maladie. Environ 75% des personnes âgées démontrent une diminution significative de leur taux d'acétylcholine, ce qui expliquerait les troubles bénins de mémoire associés à l'âge avancé. Nous connaissons actuellement 10 substances dotées de propriétés neuromodulatrices cholinergiques positives: elles sont capables d'augmenter la quantité d'acétylcholine disponible et/ou d'augmenter l'efficacité de la transmission synaptique cholinergique (voir article: Des neuromodulateurs positifs). La plupart d'entre elles ne peuvent pas être consommées par des personnes âgées en santé désirant augmenter leur taux d'acétylcholine puisque ces substances sont destinées uniquement au traitement des personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. De plus, aucune de ces substances ne possède des propriétés neuroprotectrices. Elles permettent donc d'augmenter le niveau d'acétylcholine dans le cerveau des personnes atteintes d'Alzheimer mais ne peuvent pas protéger les neurones contre les dommages causés par la bêta-amyloïde à plus long terme. Aucun test reposant uniquement sur la mémoire ne permettait de tester des substances susceptibles d'être neuromodulatrices cholinergiques. Sous la supervision du chercheur au post-doctorat, Stéphane Bastianetto, du Centre de recherche de l'Hôpital Douglas affilié à l'Université McGill et avec les conseils du Dr. Rémi Quirion, pharmacologue et directeur scientifique du Centre de recherche, j'ai voulu dans ce projet d'expo-sciences mettre au point un test in vivo permettant de mettre à l'essai des produits susceptibles d'être neuromodulateurs cholinergiques. Ceci afin de savoir si le plus puissant neuroprotecteur connu jusqu'à maintenant contre la toxicité induite in vitro par la bêta-amyloïde, l'extrait de Ginkgo biloba (Egb 761) aurait également des propriétés neuromodulatrices positives. Ce serait alors la première substance à agir à la fois sur les deux problèmes majeurs de la maladie d'Alzheimer.

L'adaptation du test de reconnaissance d'objet

Pour la mise au point du test, j'ai modifié un test de base appelé test de reconnaissance d'objet qui a fait l'objet de plusieurs études depuis une dizaine d'années. Il a été élaboré par Abdelkader Ennaceur à Paris en 1988. Il a comme avantage de ne causer aucun stress chez les rats, ne faisant appel uniquement qu'à leur réflexe d'exploration, lequel est inné chez eux. Durant une journée, chacun des rats d'un groupe de 24 dispose de deux périodes de deux minutes pour s'acclimater à une petite chambre de 45 cm x 45 cm. Cette acclimatation, c'est la phase de stabulation. Le jour suivant, deux objets identiques sont placés dans la chambre. Ces objets sont généralement de la taille des rats et sont d'un poids suffisant pour que les rats ne puissent pas être en mesure de les déplacer. Chacun des rats dispose de deux minutes pour les explorer. C'est la séance d'apprentissage. Les temps passés par les rats à explorer l'objet de gauche et l'objet de droite sont chronométrés précisément. Lorsque toutes les variables sont bien contrôlées, les rats passent en moyenne autant de temps à explorer l'objet de gauche que l'objet de droite. Une heure après la séance d'apprentissage, un des deux objets identiques est remplacé par un nouvel objet. Les temps passés par les rats à explorer l'objet nouveau et l'objet ancien sont mesurés. C'est la séance de reconnaissance. Lorsque les rats ont une mémoire intacte, ils passent définitivement plus de temps à explorer l'objet nouveau, se rappelant d'avoir exploré une heure plus tôt l'objet ancien. Ce test était effectué tel quel pour la première fois au Québec. Avant de passer au test proprement dit sur la substance susceptible d' être neuromodulatrice cholinergique, il a fallu en premier que j'élabore entièrement les paramètres expérimentaux en contrôlant l'ensemble des variables. En effet, plus de cinquante variables ont été à contrôler pour garantir la fiabilité des résultats: âge des rats, saturation en odeur, moment dans la journée, luminosité, durée du temps de stabulation / apprentissage / reconnaissance, couleur des objets… etc (voir encadré). Le test de base a donc été répété 9 fois (avec au total 186 rats) durant la phase 1 de mon expérimentation: l'élaboration de l'expérimentation. Cette phase est tellement cruciale qu'elle représente environ 90% du travail d'expérimentation. Il faut en effet s'assurer qu'aucune source de biais ne puisse s'infiltrer dans les résultats finaux éventuels. Par exemple, lors de la séance d'apprentissage, les rats doivent passer autant de temps sur l'objet de gauche que sur l'objet de droite. Si tel n'est pas le cas, comme lors des premiers essais, les rats démontrent une prépondérance spatiale: ils préfèrent aller par exemple, du côté gauche, soit parce que la luminosité y est un peu plus faible. Des erreurs et des sources de biais peuvent alors survenir durant la reconnaissance: les rats vont toujours vers la gauche. Ce n'est alors plus la mémoire des rats qui est testée mais plutôt leur préférence pour l'obscurité! Lors du premier essai, les rats passaient en moyenne 3,25 secondes de plus à explorer l'objet de gauche que celui de droite. En contrôlant plusieurs variables, la 9ème répétition du test de base a permis d'obtenir un écart de moins de 0,09 seconde entre les temps passés par les rats à explorer l'objet de gauche et l'objet de droite, ce qui n'était plus significatif. Également, il a fallu contrôler l'ensemble des variables pour obtenir un écart significatif entre les temps passés par les rats à explorer le nouvel objet et l'ancien objet lors de la reconnaissance. Ils devaient être en mesure de mémoriser les objets identiques lors de l'apprentissage. La première fois, l'écart était plus petit que 1 seconde, suggérant que la chambre initiale (de 75 cm X 75 cm) était trop grande et que les rats n'avaient pas assez de 2 minutes pour explorer les objets lors de l'apprentissage. Les dimensions de la chambre ont donc par la suite été réduites (45 cm X 45 cm) et les rats passaient en moyenne 9 secondes de plus à explorer le nouvel objet lors de la séance de reconnaissance, ce qui est définitivement significatif. Les rats se souvenaient donc de l'objet présenté une heure auparavant, lors de la séance d'apprentissage. Après avoir contrôlé les quelques 50 variables, le test fonctionnait. Aucune source de biais ne semblait être présente durant la neuvième répétition du test de base et les rats étaient pleinement en mesure de mémoriser. Je pouvais donc passer à la phase deux de l'expérimentation: le test avec l'extrait de Ginkgo biloba.

 

 

 

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Séance de reconnaissance: Séance de 2 minutes où chacun des rats est placé dans la chambre avec un des deux objets identiques de la séance d'apprentissage ainsi qu'avec un nouvel objet. Cette séance a lieu 1 heure après la séance d'apprentissage.

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Scopolamine: Alcaloïde présent dans la plante Scopolia Carniolica. Elle est antagoniste du récepteur muscarinique: elle bloque temporairement la transmission synaptique cholinergique. Elle permet de simuler l'amnésie de type Alzheimer sur des animaux.

 

 

 

 

 

Antagoniste:     Substance qui bloque la fixation d'un neurotransmetteur à son récepteur. Il inhibe la transmission synaptique en occupant le site de fixation du récepteur.

 

 

 

 

 

 

 

Contrôles:            Rats n'ayant reçu aucune substance. Ils permettent donc d'établir des comparaisons avec des rats ayant reçu des substances et de déterminer les effets de ces substances.

 

 

Le test avec l'extrait de Ginkgo biloba

Après avoir mis en place les paramètres du test de base, il fallait ensuite l'adapter à l'objectif de mon projet, c'est-à-dire pouvoir tester une substance susceptible d'être neuromodulatrice cholinergique positive, plus précisément l'extrait de Ginkgo biloba. Plusieurs variables ont été modifiées, éliminées ou ajoutées. La procédure reste la même que celle du test de base. Cependant, 30 minutes avant la séance d'apprentissage, certains rats reçoivent de la scopolamine. Cet alcaloïde est présent dans la plante Scopolia Carniolica. Il est antagoniste réversible des récepteurs muscariniques. Il inhibe temporairement la transmission synaptique des neurones cholinergiques. La scopolamine est donc un produit très intéressant pour simuler sur des animaux les déficits de mémoire et la baisse d'efficacité de la transmission synaptique cholinergique que l'on retrouve dans la maladie d'Alzheimer. Le blocage de la transmission synaptique cholinergique entraîné par la scopolamine peut être renversé: si les rats se mettent à libérer davantage d'acétylcholine (grâce à l'action d'un neuromodulateur cholinergique positif par exemple), la scopolamine est évacuée des récepteurs muscariniques et ceux-ci redeviennent activables par l'acétylcholine. La transmission synaptique cholinergique est donc restaurée. La scopolamine nous permettrait donc de savoir si un produit est neuromodulateur cholinergique ou non, en nous fournissant l'occasion de vérifier si ce produit peut renverser l'effet amnésique transitoire provoqué par le blocage des récepteurs muscariniques par la scopolamine. Le groupe des 24 rats a donc été divisé en trois groupes de 8 rats. Les rats des groupes #1 et #2 ont reçu, 30 minutes avant la séance d'apprentissage, une dose de 0,2 mg/kg de scopolamine par injection sous-cutanée. Les rats du groupe #1 ont reçu, en plus, une injection de 200 mg/kg d'extrait de Ginkgo biloba. Les rats du groupe #3 ont reçu, quant à eux, une injection d'eau saline et agissaient donc comme contrôles dans l'expérimentation. 30 minutes plus tard, chacun des rats a disposé de 2 minutes pour la séance d'apprentissage avec les deux objets identiques. Une heure plus tard, chacun des rats a encore disposé de 2 minutes pour la séance de reconnaissance avec un nouvel objet et un objet ancien. Les temps passés par les rats à explorer l'objet ancien et l'objet nouveau ont été chronométrés. Ce test avec l'extrait de Ginkgo biloba a été répété 3 fois pour valider les résultats obtenus. Ces résultats ont permis de prouver que le Ginkgo biloba avait des propriétés neuromodulatrices cholinergiques positives (voir article Ginkgo: un neuromodulateur!). En effet, plus de 12 des 24 rats du groupe #2 (injectés uniquement à la scopolamine) démontrèrent d'évidents déficits mnésiques: il passaient autant de temps sur les deux objets lors de la séance de reconnaissance. Ils n'avaient donc pas été en mesure de mémoriser l'objet durant l'apprentissage. Aucun des rats du groupe #1 (Ginkgo + Scopolamine) ne démontrèrent de déficits mnésiques, prouvant que l'extrait de Ginkgo biloba est bel et bien un neuromodulateur cholinergique positif!

Consolidation des paramètres

Dans le but de déterminer avec plus d'exactitude le niveau d'efficacité des propriétés neuro-modulatrices cholinergiques du Ginkgo biloba (faibles / moyennes / fortes) , j'ai voulu par la suite préciser plus finement deux paramètres expérimentaux en particulier: la dose de scopolamine et l'intervalle entre l'injection et la séance d'apprentissage. je visais donc à ce qu'un pourcentage encore plus parfait des rats soumis à la scopolamine démontrent une amnésie totale. J'ai donc testé différentes doses de scopolamine à différents intervalles. J'ai découvert qu'une dose de 0,2 mg/kg de scopolamine injectée une minute avant l'apprentissage, ou encore une dose de 0,4 mg/kg injectée 30 minutes avant l'apprentissage causent des amnésies encore plus fortes que la dose utilisée dans la phase 2 avec l'extrait de Ginkgo biloba (0,2 mg/kg 30 minutes avant l'apprentissage). Cela confirme donc que la scopolamine a un effet très rapide et très court d'inhibition sur la transmission synaptique cholinergique. Sur le groupe des 27 rats testés à la dose 0,2 mg/kg une minute avant l'apprentissage, 16 rats au moins démontrèrent une amnésie totale. Sur le groupe des 27 rats testés à la dose de 0,4 mg/kg 30 minutes avant l'apprentissage, 20 rats au moins démontrèrent une amnésie totale. Ces résultats confirmés, le test final du Ginkgo biloba viendra établir encore plus précisément le degré d'efficacité in vivo des propriétés neuromodulatrices cholinergiques de ce produit qui est déjà un puissant neuroprotecteur in vitro. Le test lui-même pourra par ailleurs trouver éventuellement application dans d'autres essais sur des substances potentiellement neuromodulatrices cholinergiques. <

 

 

 

 

 

 

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David Laflamme, école Montcalm, expo-sciences 2000,  tous droits réservés.